氮肥的過度使用，正在帶來嚴(yán)重的環(huán)境問題。通過生物固氮的研究來解決農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中面臨的氮肥問題是實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)綠色和可持續(xù)發(fā)展的重要研究方向。2025年10月31日，北京大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)學(xué)院楊建國課題組在微生物學(xué)權(quán)威期刊mBio上發(fā)表題為Genetic analysis of the NifM dependence of the nitrogenase iron proteins的研究論文，該研究糾正了此前對(duì)于固氮酶系統(tǒng)核心組分NifH蛋白中NifM催化位點(diǎn)的錯(cuò)誤認(rèn)識(shí)，為NifH蛋白的成熟機(jī)制提供了新的見解，該研究中鑒定到的不依賴于NifM的NifH蛋白在構(gòu)建自主固氮農(nóng)作物的研究中有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
NifH蛋白作為固氮酶的核心組分之一，承擔(dān)著固氮酶輔因子FeMoco、P簇的成熟以及還原力供給等多種功能，其正確折疊對(duì)于整個(gè)固氮酶系統(tǒng)的功能性有著至關(guān)重要的作用。在一些固氮菌中，NifH蛋白的成熟依賴于NifM蛋白的催化。NifM蛋白包含一個(gè)PpiC異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域作用于脯氨酸殘基，催化脯氨酸的順反異構(gòu)，從而促進(jìn)蛋白的折疊。在NifH蛋白中存在7個(gè)高度保守的脯氨酸殘基，早期在棕色固氮菌中的研究表明NifH蛋白258位的脯氨酸殘基是NifM的催化位點(diǎn)，該位點(diǎn)突變?yōu)榻z氨酸后能擺脫對(duì)NifM的依賴。然而，通過我們的研究發(fā)現(xiàn)，P258位點(diǎn)突變?yōu)榻z氨酸會(huì)導(dǎo)致NifH蛋白活性大幅下降，且不能擺脫對(duì)NifM蛋白的依賴。而P258位點(diǎn)突變?yōu)?span id="ctod9f8" class="">異亮氨酸、蘇氨酸以及纈氨酸能夠?qū)崿F(xiàn)與野生型NifH相當(dāng)?shù)幕钚裕且廊恍枰蕾囉?/span>NifM蛋白的催化。進(jìn)一步，我們發(fā)現(xiàn)除了P256以外的6個(gè)高度保守的脯氨酸殘基均可以被適當(dāng)?shù)陌被崽娲⒈Ａ艄δ苄裕疫@些突變體的功能均需要依賴于NifM蛋白。因此，我們推測(cè)P256位點(diǎn)更可能是NifM蛋白的催化位點(diǎn)，該位點(diǎn)突變?yōu)槿魏伟被峋鶎?dǎo)致NifH蛋白完全失活。基于此，我們提出了NifH蛋白256位點(diǎn)的脯氨酸殘基可能經(jīng)過兩輪順反異構(gòu)的假設(shè)，然而受限于實(shí)驗(yàn)條件我們未能驗(yàn)證該假設(shè)。
另外，在大部分的固氮菌中，并沒有鑒定到NifM的同源蛋白，但是這些固氮菌中的NifH蛋白依然保留了7個(gè)保守的脯氨酸殘基，包括256位點(diǎn)的脯氨酸殘基。對(duì)于這些固氮菌中的NifH蛋白的成熟是否需要NifM蛋白的參與或者內(nèi)源包含PpiC結(jié)構(gòu)域蛋白的參與依然是未知的。為了驗(yàn)證這類固氮菌中NifH蛋白的成熟是否需要依賴于PpiC結(jié)構(gòu)域，我們選取了來自芽孢桿菌的NifH作為代表，在模式大腸桿菌底盤中進(jìn)行驗(yàn)證。我們首先將大腸桿菌中包含PpiC結(jié)構(gòu)域蛋白的編碼基因ppiC、ppiD以及surA進(jìn)行了單敲除以及組合敲除。最終發(fā)現(xiàn)在敲除所有包含PpiC結(jié)構(gòu)域編碼基因的大腸桿菌中，在沒有NifM蛋白參與的條件下，來自芽孢桿菌的NifH依然能夠正常發(fā)揮功能。證明了這類固氮菌中來源的NifH蛋白不需要依賴于NifM或PpiC結(jié)構(gòu)域催化成熟。然而，這些NifH中P256位點(diǎn)是如何跨過能量壁壘，完成順反異構(gòu)依然需要進(jìn)一步的研究。
北京大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)學(xué)院楊建國研究員為本論文通訊作者；北京大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)學(xué)院謝卓婷、蔡舒怡以及陳昊洋為論文的共同第一作者；中國農(nóng)業(yè)大學(xué)孔姝媛和北京林業(yè)大學(xué)唐樂天參與了本研究；論文得到北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、崖州灣國家實(shí)驗(yàn)室王憶平教授的支持。該研究得到了國家自然科學(xué)基金、國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目以及北京大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)學(xué)院的資助。
楊建國課題組常年招收博士研究生及博士后，歡迎對(duì)生物固氮以及合成生物學(xué)感興趣的同學(xué)加入課題組！
原文鏈接：https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.02642-25