將固氮酶系統(tǒng)導(dǎo)入農(nóng)作物細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)其自主固氮，從而減少甚至替代工業(yè)氮肥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用是生物固氮研究的終極目標(biāo)。2020年6月29日，北京大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)學(xué)院楊建國(guó)課題組與合作者在美國(guó)科學(xué)院院刊《PNAS》上以Article的形式在線發(fā)表了題為“Using synthetic biology to overcome barriers to stable expression of nitrogenase in eukaryotic organelles”的研究論文，研究揭示了固氮酶核心酶組分NifD蛋白在真核細(xì)胞器線粒體中的不穩(wěn)定性機(jī)制，同時(shí)進(jìn)一步篩選到了在線粒體具有高穩(wěn)定性的NifD突變體，從而向構(gòu)建真核適用的穩(wěn)定通用高效的固氮酶系統(tǒng)邁出了重要的一步，為實(shí)現(xiàn)農(nóng)作物自主固氮的最終目標(biāo)進(jìn)一步打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
工業(yè)氮肥的施用滿足了農(nóng)作物的高產(chǎn)需求，同時(shí)也帶來了土壤板結(jié)、水體富營(yíng)養(yǎng)化等環(huán)境問題。當(dāng)流失的硝酸鹽氮肥被轉(zhuǎn)化為二氧化氮時(shí)，還可致人予癌癥、心臟病，以及產(chǎn)生高于二氧化碳的溫室效應(yīng)。因此，工業(yè)氮肥的大量施用嚴(yán)重阻礙了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。相反，生物固氮是自然界中的部分原核微生物利用體內(nèi)復(fù)雜的固氮酶系統(tǒng)，在常溫常壓下將大氣中的氮?dú)廪D(zhuǎn)換為生物體可利用的氨的過程。如何利用生物固氮這種大自然提供的綠色氮肥以減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)對(duì)工業(yè)氮肥的依賴，是擺在研究者面前的重要科學(xué)問題。通過生物工程方法，改造現(xiàn)有固氮系統(tǒng)，并最終將改造后的固氮系統(tǒng)直接導(dǎo)入到農(nóng)作物的線粒體、葉綠體等靶細(xì)胞器，是實(shí)現(xiàn)農(nóng)作物自主固氮，是實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中氮肥“綠色革命”的夢(mèng)想。
合成生物學(xué)的發(fā)展為這一夢(mèng)想的實(shí)現(xiàn)帶了新機(jī)遇，但是研究人員在利用合成生物學(xué)將固氮酶系統(tǒng)向真核系統(tǒng)轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)現(xiàn)，來自棕色固氮菌和產(chǎn)酸克雷伯菌的固氮酶核心酶組分NifD蛋白無法在酵母及植物的線粒體中穩(wěn)定表達(dá)。因此，固氮酶系統(tǒng)核心酶組分在真核細(xì)胞器中的穩(wěn)定性成為了新的限制因素。為了解決這一問題楊建國(guó)課題組與合作者開展了一系列研究工作。首先，在NifD蛋白序列上確定了其在線粒體中涉及其穩(wěn)定性的相關(guān)區(qū)域，并通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)在該區(qū)域內(nèi)鎖定了一個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基：NifD-R98；其次，發(fā)現(xiàn)NifD蛋白的R98位氨基酸殘基在序列上高度保守，當(dāng)將四種具有代表性的固氮菌來源的NifD蛋白在酵母線粒體中分別表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)它們均高度不穩(wěn)定，因此推斷NifD-R98位導(dǎo)致的其在線粒體中的不穩(wěn)定性對(duì)于不同物種來源的NifD蛋白存在普遍性。接下來以大腸桿菌為底盤，分別重構(gòu)了來源于酵母、水稻、煙草和擬南芥的功能性線粒體信號(hào)肽酶（mitochondrial-processing peptidase，MPP）的功能模塊；當(dāng)這些MPP功能模塊分別與攜帶野生型NifD及其R98突變體的固氮酶系統(tǒng)進(jìn)行共表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)MPP直接參與了對(duì)固氮酶核心酶組分NifD蛋白的降解，而其相對(duì)應(yīng)的R98突變體乃至其它固氮酶組分均可穩(wěn)定表達(dá)。由此可見，NifD蛋白在線粒體中的不穩(wěn)定性是由線粒體MPP酶的錯(cuò)誤切割造成的；更重要的是，由于NifD蛋白的R98位氨基酸殘基在結(jié)構(gòu)上負(fù)責(zé)與固氮酶另一核心蛋白NifK的相互作用，暗示著突變?cè)撐稽c(diǎn)的極可能對(duì)固氮酶穩(wěn)定性產(chǎn)生重要影響。最終通過對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變及活性測(cè)定，找到了合適的NifD-R98位變體，它們既可保持較高的固氮酶活性，又能在酵母線粒體中穩(wěn)定表達(dá)（見配圖），這些NifD-R98位的突變體可用于未來在農(nóng)作物細(xì)胞線粒體中構(gòu)建具有完整功能性的固氮酶系統(tǒng)。此外，該研究首次以合成生物學(xué)手段在大腸桿菌中重構(gòu)了四種定位于線粒體的蛋白穩(wěn)定性檢測(cè)系統(tǒng)，能夠?qū)δ康牡鞍资欠駮?huì)被MPPs錯(cuò)誤切割做出預(yù)評(píng)估，從而為線粒體定位的異源蛋白穩(wěn)定性測(cè)試提供了便捷工具。
配圖：固氮酶核心酶組分NifD蛋白及其穩(wěn)定突變體在酵母及植物線粒體中定位表達(dá)示意圖。野生型NifD（NifDwt）蛋白中由于存在一個(gè)天然的疑似內(nèi)在線粒體信號(hào)肽酶（Mitochondrial-Processing Peptidase, MPP）切割位點(diǎn)，而被錯(cuò)誤切割，從而導(dǎo)致其無法正確折疊；而NifD-R98P（NifDR98P）等突變體通過對(duì)NifD蛋白天然切割位點(diǎn)的突變限制了MPP酶的切割，從而保證了NifD蛋白的正確折疊。
北京大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)學(xué)院楊建國(guó)研究員與北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王憶平教授、英國(guó)John Innes Centre研究中心Ray Dixon教授為論文共同通訊作者。北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2017級(jí)博士研究生相楠為論文第一作者，2019級(jí)博士生郭琛月、2018級(jí)PTN項(xiàng)目博士生徐昊以及已畢業(yè)的劉繼偉博士參與了研究工作。該研究得到了科技部國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“合成生物學(xué)”重點(diǎn)專項(xiàng)、國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目、北京大學(xué)生科啟東創(chuàng)新基金、蛋白質(zhì)與植物基因研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的資助。
原文鏈接：https://www.pnas.org/content/early/2020/06/24/2002307117
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